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技術文章
潮霉素B的作用機理及生物應用分享
   潮霉素B Hygromycin B是由吸水鏈霉菌(Streptomyces hygroscopicus)代謝產生的一種氨基糖苷類抗生素,通過抑制蛋白質合成而殺死細菌、真菌和高等真核細胞。潮霉素B通過干擾70S核糖體易位和誘導對mRNA模板的錯讀而抑制蛋白合成。目前常用于篩選和維持培養含潮霉素抗性基因的原核或真核細胞。

  對潮霉素B Hygromycin B的抗性基因:

  對潮霉素B的抗性源自編碼潮霉素B磷酸轉移酶(Hph)的基因。至今發現兩種來源:

  1.Streptomyces hygroscopicus產生的Hph抗性基因;

  2.Escherichia coli,Klebsiella pneumoniae內質粒攜帶的Hph抗性基因(常用);

  潮霉素B Hygromycin B的生物應用:

  1) 篩選和維持培養穩定轉染Hph+載體的原核細胞或真核細胞(植物細胞和哺乳動物細胞);

  2) 由于作用模式的差異,常與G418 (GeneticinTM),Zeocin™ 和blasticidin S聯合使用,篩選穩定轉染兩個不同載體的細胞株;

  3)抗病毒劑,由于潮霉素B選擇性滲透進入病毒感染增強通透性的細胞,而且具有抑制翻譯的功效;

  4)作為驅蟲藥加入動物飼料;

  應用濃度:

  潮霉素B用來篩選穩轉株的工作濃度需要根據細胞類型,培養基,生長條件和細胞代謝率而變化。推薦使用濃度為50-1000 μg/mL,濃度需要殺滅曲線來確定。

  哺乳動物細胞·200-500 μg/mL;細菌/植物細胞·100-300 μg/mL;真菌·300-1000 μg/mL;

  潮霉素B Hygromycin B的兩種使用方法如下:

  使用一:殺滅曲線確定殺死濃度(僅作參考,因個人檢測體系而異)

  (1)往組織培養級的96孔板內加入未轉染細胞,細胞密度約50-200細胞/孔;細胞貼壁之后,往每孔加入含不同濃度(如50-1000μg/mL,至少5個濃度)潮霉素B的200μL新鮮培養基;

  (2)37℃,5% CO2培養箱孵育細胞10-14天;

  (3)培養5-7天后更換新的培養液,培養液內含有相應濃度的潮霉素B;

  (4)10-14天后使用細胞增殖方法如MTT,CCK-8等評估細胞活力;也可以通過檢測細胞克隆數或百分比匯合率來確定毒性效應。一般選擇在10-14天能夠殺死所有細胞的小濃度為篩選濃度。

  使用二:篩選穩定轉染細胞

  (1) 對于貼壁細胞,直接吸去60mm培養皿內的轉染細胞培養基,然后加入含有潮霉素B的新鮮培養基5-6ml;對于懸浮細胞,無菌條件250x g,離心10min除去舊的轉染細胞培養基,然后懸浮在約5ml的含潮霉素B的新鮮培養基;

  (2) 5-7天后,如上方法更換含有潮霉素B的新鮮培養基;

  (3) 再孵育細胞5-7天;

  (4) 10-14天孵育后,培養體系中只含有能夠表達潮霉素B抗性表型的活細胞。因此篩選之后如步驟一,更換不含潮霉素B的新鮮培養基。

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